Processus de fermentation et d'extraction de la pénicilline acylase

1.1. Pénicilline acylase et ses caractéristiques

Pénicilline acylase, également connue sous le nom de pénicilline acylase aminohydrolase, ou pénicilline acylase aminohydrolase. Il est principalement obtenu à partir d'enzymes intracellulaires d'Escherichia coli, d'enzymes extracellulaires de Bacillus mégaceus et d'enzymes intracellulaires de Pichia pastoris. Il a été largement utilisé dans la production d'intermédiaires importants d'antibiotiques β-lactamines et d'antibiotiques β-lactame semi-synthétiques. La pénicilline acylase est une enzyme qui catalyse spécifiquement les réactions de pénicilline. La pénicilline acylase est principalement utilisée dans le processus de production d'acide 6-aminopépillanique (6-APA). La 6-APA est principalement obtenue en désacylant la pénicilline G à travers la pénicilline acylase. De plus, en raison des propriétés antibactériennes, antigéniques et allergènes de la pénicilline acylase, il est difficile d'être décomposé par des enzymes dans les cellules bactériennes; en outre, en raison de la formation facile de résidus d'antibiotiques β-lactame par la pénicilline acylase et du problème de cancérogénicité, Le traitement et le contrôle de ces substances a toujours été un problème difficile dans le domaine de la recherche sur les antibiotiques.

1.2. Qu'est-ce que l'acylation?

L'acylation est également appelée acylation. L'acylation fait référence à la réaction d'introduction d'acyl RCO aliphatique-ou acyl ArCO aromatique-dans des atomes d'azote, d'oxygène, de carbone ou de soufre dans des molécules organiques. Les produits après acylation sont des composés tels que les cétones (aldéhydes), les amides et les esters. Les réactions d'acylation peuvent être divisées en acylation d'oxygène, acylation d'azote et acylation de carbone en fonction du site d'introduction d'acyle. Les agents d'acylation sont généralement des acides carboxyliques ou des dérivés d'acide carboxylique. Les réactions d'acylation peuvent également être classées en fonction du type d'agents acylants.

2 Méthode d'extraction de la pénicilline acylase

Comment recycler et purifier la pénicilline acylase, en particulier en utilisant Escherichia coli ou Pichia pastoris pour le génie génétique. C'est un lien très important, et cette étape a un grand impact sur la qualité de la pénicilline acylase.

2.1. Perturbation ultrasonique. Chromatographie

La perturbation ultrasonique, la chromatographie et la purification par extraction sont des techniques de bioséparation couramment utilisées qui peuvent être utilisées pour séparer, purifier et extraire des biomacromolécules telles que les protéines et les acides nucléiques. L'ensemble du processus est généralement effectué à basse température (0 ~ 4 ℃) pour éviter la dégradation et les dommages de l'échantillon. Dans cette étude, Escherichia coli a été utilisée comme principale bactérie génétiquement modifiée pour l'extraction liquide d'enzymes brutes. L'élimination de la paroi cellulaire, de l'acide nucléique et des parties lipidiques dans l'extrait peut rendre la protéine cible plus pure et plus stable. Afin d'obtenir de meilleurs résultats, l'étude a adopté une variété de méthodes de purification efficaces telles que la méthode de sédimentation segmentée par sulfate d'ammonium, la méthode de colonne chromatographique, DAE-méthode d'ingénierie de conception de fibres alimentaires-chromatographie sur 52 colonnes, chromatographie sur gel material-200-hydroxyapatite colonne, etc. Des études ont montré que l'activité spécifique de la solution d'enzyme brute d'Escherichia coli est médiocre, Et généralement quatre à cinq étapes de purification sont nécessaires pour obtenir une activité spécifique plus élevée. La technologie de broyage, de chromatographie et de purification par ultrasons peut être utilisée efficacement pour purifier la solution enzymatique brute d'Escherichia coli, fournissant une base fiable pour la recherche et l'application fonctionnelles ultérieures.

2.2. Pression osmotique d'impact

La technologie d'impulsion à haute pression est largement utilisée dans l'extraction et la purification de biomacromolécules. La pénicilline acylase est une protéase intracellulaire principalement distribuée sur la membrane cellulaire et la paroi cellulaire, et est souvent utilisée dans la préparation d'antibiotiques. Dans cette étude, la pénicilline acylase a été extraite par la technologie d'impulsion à haute pression, et la solution enzymatique brute obtenue avait une activité plus élevée. Grâce à la précipitation avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium, une vitesse de réaction plus élevée peut être obtenue en même temps, et elle peut être appliquée directement à l'immobilisation. Afin d'extraire efficacement la pénicilline acylase, l'étude a utilisé la méthode de choc de pression osmotique, qui est une méthode d'extraction simple et facile qui ne nécessite pas trop d'instruments et a un large éventail d'applications. Cette méthode mouille Escherichia coli dans une solution hypertonique, puis la déplace vers un milieu hypotonique. Par l'action de la pression osmotique, la paroi cellulaire se rompt et l'enzyme est excrétée du corps. Cette méthode peut prévenir le problème de la libération excessive de substances contenues en raison d'une rupture complète et maintenir efficacement le taux de survie des bactéries. Après obtention de l'enzyme brute, elle peut être purifiée par des méthodes telles que la précipitation au sulfate d'ammonium et l'analyse par chromatographie sur colonne DEAE-cellulose-52 pour obtenir une enzyme d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec une structure à bande unique. C'est précisément à cause deLe procédé d'impact de pression osmotique selon lequel l'intégrité de la paroi cellulaire et le taux de survie bactérienne sont maintenus pendant le processus d'extraction, obtenant ainsi une solution d'enzyme brute avec une activité spécifique plus élevée. De plus, cette méthode d'extraction aide également à conserver la structure de la bande enzymatique, aidant ainsi à obtenir la pénicilline acylase de haute pureté et à activité spécifique élevée.

2.3. Traitement adsorbant

La pénicilline acylase est une enzyme importante et a une valeur d'application importante dans la préparation d'antibiotiques. Dans cette étude, afin de séparer la pénicilline acylase du bouillon de fermentation, la méthode d'adsorption a été utilisée pour la séparation. L'utilisation d'hydroxyde d'ammonium pour traiter la terre de diatomées peut extraire directement la pénicilline acylase et fonctionner à température ambiante, avec un rendement d'activité enzymatique élevé et de bonnes perspectives d'application industrielle. Pour la collecte des bactéries, la consommation énergétique de la méthode de séparation centrifuge est élevée en raison de la petite taille des micro-organismes et de la difficulté de précipitation. De plus, la méthode de floculation unique ne peut pas collecter complètement les bactéries. Par conséquent, une combinaison de floculants et de la technologie de centrifugation peut être utilisée pour collecter des bactéries afin d'améliorer l'efficacité de la collecte et de réduire la consommation d'énergie centrifuge. De nombreux facteurs affectent l'activité enzymatique lors de la production et de l'extraction de la pénicilline acylase, tels que le type, la concentration, la température, etc. des solvants. La méthode d'ajustement du dosage et du pH de l'enzyme extraite est également très critique. Habituellement, le bouillon de fermentation peut être prétraité pour maximiser l'activité enzymatique, puis l'adsorbat est ajouté et la pénicilline acylase est séparée. Cette méthode peut rendre la production et la séparation de la pénicilline acylase plus efficaces et stables.

3 Processus de fermentation de la pénicilline acylase

3.1. Préparation des spores

Pour les souches améliorées du sol sableux, l'amélioration génétique peut être réalisée en utilisant des milieux de culture contenant du glycérol, du glucose, des protéines, etc. Dans les conditions de la température de croissance optimale de 25-26 ℃ et 6-8 jours, des colonies uniques peuvent être obtenues et une propagation oblique peut être effectuée, Et les spores obliques peuvent être obtenues après 7 jours. Ces spores peuvent être transplantées dans un milieu de culture solide de grain ou de riz de haute qualité, et la culture de souche de millet avec 3 stades de croissance pendant 7 jours à 25 ℃ doit ajouter plus de source de carbone et de source d'azote organique pour obtenir une grande quantité d'hyphes. Pour les spores produites pendant le processus de fermentation, des expériences de flacon à secousses doivent être effectuées pour vérifier l'efficacité et l'état des bactéries étrangères. De plus, pendant le processus de culture des réservoirs de semences et des cuves de fermentation, une grande quantité d'hyphes doit être obtenue en ajoutant une source de carbone et une source d'azote organique. Processus de fermentation pour la production de pénicilline Pendant la fermentation de la pénicilline acylase, une teneur élevée en oxygène dissous et un taux de ventilation sont nécessaires, et le débit d'air est généralement 1:1 ~ 1:5. La vitesse d'agitation doit être modérée, généralement 150 ~ 200r/min. Au début de la fermentation, le pouvoir d'agitation est important, ce qui peut favoriser la croissance des bactéries. De plus, le contrôle de paramètres tels que le temps et la température à chaque étape de la fermentation doit également être ajusté en fonction de différentes souches et conditions de fermentation. La cuve de fermentation est le principal maillon de la production à grande échelle de pénicilline acylase. Dans la cuve de fermentation, une variété de substances, telles que la poudre de gâteau d'arachide, la poudre de son, le sirop de maïs, le glucose, l'urée, etc., peut être ajouté pour améliorer l'état nutritionnel et le taux de croissance des bactéries. Lors de l'inoculation, il est recommandé de contrôler la quantité d'inoculation de mycélium entre 12% et 15% pour éviter le gaspillage et réduire les coûts. En outre, lors de la manipulation des déchets liquides générés pendant le processus de fermentation, il convient de prêter attention à la protection de l'environnement. Les déchets liquides peuvent contenir une variété de substances nocives et de polluants, qui doivent être strictement traités et rejetés.

3.2. Contrôle de la fermentation de la pénicilline acylase

Le processus de préparation de la pénicilline acylase a obtenu de la pénicilline acylase dans des conditions de culture appropriées, de température, de ventilation et de culture d'agitation. Avant la fermentation, l'équipement et les médias concernés (principalement source de carbone, source d'azote, précurseur et sel inorganique) sont désinfectés, puis le liquide de semence est connecté. Pendant cette période, afin de maintenir une certaine température et pression, des défoamers sont souvent ajoutés. Si la valeur du pH du liquide de fermentation est contrôlée par l'acide et l'alcali, des sels de glucose et d'ammonium doivent être ajoutés par intermittence ou en continu pour compléter la source de carbone et la source d'azote, ou d'autres précurseurs liquides doivent être ajoutés pour augmenterLe rendement de la pénicilline acylase.

3.3. Caractéristiques du processus de fermentation de la pénicilline acylase

Dans le processus de production de pénicilline acylase, la solution de sucre est l'un de ses principaux nutriments, et la teneur en solution de sucre peut affecter directement la production et le rendement de la pénicilline acylase. Si le taux d'addition de sucre est trop faible, le taux de croissance du mycélium diminuera, affectant ainsi l'activité et la production des bactéries, tandis qu'un rapport de sucre élevé fera augmenter la viscosité du liquide de fermentation, le nombre de mycélium augmente et l'oxygène dissous diminue rapidement, Affectant le progrès normal de la fermentation. Par conséquent, afin de produire de la pénicilline acylase efficace, la teneur en solution de sucre doit être contrôlée avec précision. À l'heure actuelle, une certaine courbe de teneur en sucre est généralement utilisée, qui est basée sur des données expérimentales et a été optimisée et améliorée. Cependant, étant donné que les matières premières de chaque lot de production sont différentes et que les caractéristiques de variété de chaque lot sont différentes en raison de germoplasmes différents, si seulement la même courbe de teneur en sucre est utilisée pour l'addition, certains produits auront des rendements insuffisants. Par conséquent, comment ajuster avec précision la teneur en sucre en fonction de l'état métabolique du mycélium est l'une des clés pour contrôler le processus de production de la pénicilline acylase. Différentes courbes de teneur en sucre peuvent être utilisées pour l'ajustement en fonction de l'état métabolique du mycélium. Lorsque le nombre de mycélium est faible au début de la fermentation, le taux d'addition de sucre de la solution de sucre peut être progressivement augmenté pour accélérer le taux de croissance du mycélium. Dans le même temps, au milieu et à la fin de la fermentation, la teneur en solution de sucre doit être contrôlée pour éviter une accumulation excessive de sucre affectant le métabolisme normal du liquide de fermentation. De plus, la courbe de teneur en sucre peut être ajustée dynamiquement en fonction de la teneur en solution de sucre détectée en temps réel, de manière à contrôler plus précisément la teneur en solution de sucre.

4 Processus d'extraction de la pénicilline acylase

4.1. Prétraitement

Une fois la fermentation terminée, il existe dans le bouillon de fermentation Monascus sous la forme d'une intensité minimale de 10 ~ 30kg/m3, qui contient une grande quantité d'ions inorganiques à haute teneur en oxygène (Ca, Mg, Fe), de mycélium, de milieu de culture inutilisé, de cellules facilement contaminées, de métabolites de pathogènes, de protéines, Etc. Son objectif principal est d'enrichir le produit cible et d'éliminer une grande quantité d'impuretés pour une séparation et une purification supplémentaires.

4.2. Filtration

Le bouillon de fermentation doit être prétraité avant l'extraction. Une petite quantité de floculant (comme l'alun) peut être ajoutée au bouillon de fermentation, ou la valeur du pH du bouillon de fermentation peut être ajustée au point isoélectrique de la protéine pour précipiter la protéine, Puis le liquide flottant est pompé dans chaque chambre filtrante scellée du filtre à travers un tambour à vide (en utilisant la pression négative comme puissance de filtration) ou une cartouche filtrante plate. Sous pression de travail, la séparation solide-liquide est réalisée à travers une membrane filtrante ou d'autres gâteaux filtrants. La pénicilline acylase se dégradant facilement à température ambiante, la température du bouillon de fermentation et du filtrat est inférieure à 10 ° C et son rendement est supérieur à 90%.

4.3. Extraction

La pénicilline acylase a été isolée de la pénicilline acylase par extraction par solvant. C'est une méthode de concentration et de purification des antibiotiques à partir d'une phase liquide (e.g. filtrat de fermentation) vers une autre phase liquide (e.g. solvant organique) dans différentes conditions de pH, dans différents états chimiques (acide libre ou sels), dans des solvants insolubles dans l'eau. Puisqu'il y a un groupe carboxyle dans la structure des molécules de pénicilline acylase et que son pKa est 2.75, l'acide libre se forme lorsque sa solution aqueuse est acidifiée à un pH d'environ 2.0. L'acide pénicilline acylase a une solubilité extrêmement faible et de bonnes propriétés d'extraction de solvant dans les alcools, les cétones, les éthers, les esters, etc., de sorte qu'il peut être séparé et purifié du bouillon de fermentation.

La pénicilline acylase est transférée dans un solvant organique sous un environnement acide, la valeur du pH est ajustée à environ 2.0, puis elle entre dans une phase aqueuse neutre, extraite plusieurs fois et finalement purifiée. La pénicilline acylase avec un coefficient de partage plus élevé est généralement utilisée. L'acétate de butyle et l'acétate de n-pentyle sont principalement utilisés dans la production industrielle. Le pH de l'acétate de butyle extrait du bouillon de fermentation est de 1.8 ~ 2.0 et le pH de l'acétate de butyle extrait à nouveau dans la phase aqueuse est de 6.8 ~ 7.4. Les résultats expérimentaux montrent que le rapport du filtrat de fermentation à la solution d'acétate de butyle est de 1.5 ~ 2.1. Les solutions tampons de sulfate et de carbonate sont nousEd pour extraction arrière pour éviter les fluctuations du pH. Le rapport du bouillon de fermentation à la solution est de 3 ~ 4. Après de multiples extractions et 10 concentrations, sa concentration répond fondamentalement aux conditions de cristallisation et le rendement total d'extraction atteint 85%. La solution de tamisage obtenue est principalement une extraction secondaire, en utilisant 10% solution d'acide sulfurique avec un pH de 2.0 ~ 3.0, puis de l'acétate de butyle est ajouté, dont la quantité est d'environ 1/3 de la solution de tamisage, et l'extraction du dos est généralement réalisée avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium avec un pH de 7.0 ~ 8.0. Pendant le processus d'extraction primaire, en raison de la concentration élevée de protéines dans la filtration, un démulsifiant doit être ajouté. La première étape est l'extraction, contenant des protéines et l'ajout de PPB 0.05% ~ 0.1%.

4.4. Extraction

Afin de réduire la dégradation de la pénicilline acylase, elle doit être réalisée à une température basse inférieure à 10 ℃. La saumure dans le réservoir d'extraction est congelée. Au cours de l'extraction, la température et l'acidité ont une grande influence sur la dégradation de la pénicilline acylase, qui est un facteur important affectant sa dégradation. De nombreux chercheurs ont mené de nombreuses recherches à ce sujet et ont mené une discussion détaillée sur l'influence de la température des eaux usées et de l'humidité de différentes valeurs de pH sur sa demi-vie de dégradation. Les résultats montrent que la plage de stabilité de la pénicilline acylase est de pH 5.0 ~ 8.0, et elle montre une forte stabilité à pH 6.0, et elle peut être rapidement dégradée dans des conditions acides et alcalines. Grâce à l'ajustement de la courbe, la relation entre la demi-vie de dégradation de la pénicilline acylase à différentes températures et la valeur du pH est obtenue.

4.5. Cristallisation

Du charbon actif est ajouté à l'extrait pour éliminer les pigments, les sources de chaleur, filtrer et éliminer le charbon actif. L'extrait est généralement raffiné par cristallisation. Dans l'acétate de butyle, étant donné que la solubilité du sel de potassium de la pénicilline acylase est très faible, le sel de potassium de la pénicilline acylase cristallisera après avoir ajouté de l'acétate de potassium-éthanol. Sur cette base, le potassium est dissous dans une solution aqueuse de KOH par la méthode de recristallisation, la valeur du pH est ajustée à neutre, le butanol est ajouté et enfin le produit pur est obtenu par distillation azéotropique. (1) Méthode de cristallisation directe: L'extrait d'acétate de butyle est mis à réagir avec de l'acétate de sodium-éthanol pour obtenir du sel de sodium cristallin. Le sel de potassium de la pénicilline acylase est obtenu en mélangeant acétate de potassium-éthanol-acétate de potassium. (2) Méthode de distillation azéotropique: Après extraction, elle est extraite avec de l'hydroxyde de sodium 0.5 mol/L et la valeur du pH est ajustée à 6.4 ~ 6.8 pour obtenir une solution saline physiologique contenant du sodium. À 16 ~ 26 ℃ et 0.67 ~ 1.3 kPa, 2.5 fois le butanol est ajouté. L'eau et le n-butanol sont évaporés azéotropiquement. Les cristaux d'ions sodium sont précipités. Les cristaux sont lavés et séchés pour obtenir des produits de pénicilline acylase.